Інгібування амідами заміщених бензойних кислот цитоплазматичної алкогольдегідрогенази печінки щурів

Abstract

Дослідження проводили з використанням цитоплазматичної алкогольдегідрогенази печінки щурів, яку отримували методом диференціального центрифугування. Активність фермента визначали спектрофотометричним методом. Для вивчення кінетичного характеру взаємодії ферменту з інгібіторами використовували розчини амідів заміщених бензойних кислот в диметилацетаміді в концентраціях 12,5-100 мкМ. Отримані дані представляли в координатах подвійних обернених величин за методами Lineweaver-Burk та Yoshino-Murakami. Досліджені аміди заміщених бензойних кислот є інгібіторами цитоплазматичної алкогольдегідрогенази. Серед досліджених сполук найбільш ефективно пригнічує активність фермента 2,4-дихлор-5-метилбензамід (на 60%). Він виявляє змішаний характер інгібування по відношенню до етанолу при насичуючих концентраціях NAD+. Поглиблене вивчення даного процесу показало, що при низьких концентраціях етанолу (до 2 мМ) амід знижує активність ферменту за неконкурентним типом з константою інгібування 35 мкМ. При збільшенні концентрації спирту характер інгібування змінюється на безконкурентний. Серед амідів заміщених бензойних кислот виявлено ефективний інгібітор активності алкогольдегідрогенази - 2,4-дихлор-5-метилбензамід. Інгібітор активності алкогольдегідрогенази 2,4-дихлор-5-метилбензамід може бути використаний як потенційний антидот при отруєннях токсичними спиртами для запобігання утворенню більш токсичних продуктів їх біотрансформації.

Исследования проводились с использованием цитоплазматической алкогольдегидрогеназы печени крыс, которую получали методом дифференциального центрифугирования. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом. Для изучения кинетического характера взаимодействия фермента с ингибиторами использовали растворы амидов замещенных бензойных кислот в концентрациях 12,5-100 мкм. Полученные данные представляли в координатах двойных обратных величин по методам Lineweaver-Burk и Yoshino-Murakami. Исследованные амиды замещенных бензойных кислот являются ингибиторами цитоплазматической алкогольдегидрогеназы. Наиболее эффективно (до 60%) подавляет активность фермента 2,4-дихлор-5-метилбензамид. Он проявляет смешанный характер ингибирования по отношению к этанолу при насыщающих концентрациях NAD+. Углубленное изучение данного процесса показало, что при низких концентрациях этанола (до 2 мМ) амид снижает активность фермента по неконкурентному типу с константой ингибирования 35 мкМ. При увеличении концентрации спирта характер ингибирования становится бесконкурентным. Среди исследованных бензамидов обнаружен эффективный ингибитор активности NAD+-зависимой АДГ- 2,4 дихлор-5-метилбензамид. Выявлен эффективный ингибитор алкогольдегидрогеназы, который может применяться как потенциальный антидот при отравлениях токсическими спиртами и продуктами их биотрансформации.

The main purpose of this work was to investigate the influence of substituted benzoic acid amides on the activity of NAD+- dependent alcohol dehydrogenase in vitro, to study the kinetic nature of the effective inhibitors interaction with the enzyme, to establish the relationship between the chemical structure of compounds and their influence on the rate of the enzymatic reaction. The studies were carried out using rat liver cytoplasmic alcohol dehydrogenase, which was obtained by differential centrifugation. The enzyme activity was determined by spectrophotometric method. To study the kinetic nature of the enzyme interaction with inhibitors, solutions of substituted benzoic acid amides at concentrations of 12.5-100 μM were used. The obtained data were presented in double reciprocal coordinates using the Lineweaver-Burk and Yoshino-Murakami methods. An effective reversible inhibitor of cytoplasmic ADH was revealed among the studied substituted benzoic acid amides. 2.4-dichloro-5-methylbenzamide inhibited the enzyme activity up to 60%. It exhibited a mixed character of inhibition in relation to ethanol at saturating concentrations of NAD+. An in-depth study of this process showed that the amide inhibited the enzyme activity in a non-competitive type at low ethanol concentrations (up to 2 mM) with an inhibition constant of 35 μM. When the alcohol concentration was increased, the character of inhibition became uncompetitive. The kinetic type of the interaction between the NAD+ - dependent alcohol dehydrogenase and the new inhibitor of its activity was investigated. The new ADH inhibitor has been identified. It can be used as a potential antidote for poisoning with toxic alcohols and their biotransformation products.